Po 25 dniach statycznej inkubacji w temperaturze 28°C, lakkaza z *Pleurotus ostreatus* NRC620 wykazała najwyższą aktywność w podłożu hodowlanym grzybów. Optymalne wartości pH i temperatury dla tego enzymu wynosiły odpowiednio 3,0 i 70°C. Po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 40°C i 50°C aktywność enzymu utrzymywała się na poziomie odpowiednio 68,33% i 59,61%. Po 2 godzinach inkubacji w buforze cytrynianowo-fosforanowym (pH 7,0) aktywność enzymu utrzymywała się na poziomie 100%. Dodatek 10 mM MgSO₄ i CuSO₄ zwiększył aktywność enzymu odpowiednio o około 21% i 35%, podczas gdy NaCl, MnCl₂, KCl i CaCl₂ zahamowały aktywność enzymu. Przy zastosowaniu ABTS jako substratu, parametry kinetyczne (Km i Vmax) lakkazy *Pleurotus ostreatus* NRC 620 wyniosły odpowiednio 1,99 mM i 16 217 μmol min−1 L−1. Enzymatyczna obróbka próbek soku jabłkowego znacząco obniżyła zarówno pH, jak i lepkość, a redukcja ta była skorelowana z wydłużeniem czasu przechowywania. Obróbka lakkazą spowodowała nieznaczne obniżenie całkowitej zawartości fenoli w soku jabłkowym, ale nie zaobserwowano spadku aktywności antyoksydacyjnej.
W ostatnich latach naukowcy skupili się na zastosowaniu zielonej biotechnologii w przemyśle spożywczym. Lakaza jest jednym z najprzydatniejszych enzymów w przemyśle spożywczym, znajdującym zastosowanie w takich obszarach jak przetwórstwo soków, pieczenie, stabilizacja wina oraz poprawa właściwości organoleptycznych produktów spożywczych.1Wiele wyższych roślin i mikroorganizmów wydziela lakkazę,2a grzyby takie jak Deuteromycetes, Ascomycetes i Basidiomycetes również mogą wytwarzać lakkazę.3Lakaza (EC 1.10.3.2) to niebieska oksydaza, która redukuje tlen cząsteczkowy do wody za pomocą układu trzech różnych atomów miedzi, utleniając w ten sposób różne związki fenolowe i aminy aromatyczne. Podczas produkcji soków owocowych i warzywnych, proces brązowienia enzymatycznego i nieenzymatycznego jest kluczowym zagadnieniem.4Ponieważ substancje te negatywnie wpływają na kolor, smak i aromat soku, należy je usunąć.5
Spośród wszystkich owoców, jabłka są najchętniej spożywane na świecie i w Unii Europejskiej. W 2019 roku produkcja jabłek zajęła trzecie miejsce na świecie, przekraczając 87 milionów ton.6Jabłka zawierają liczne związki fenolowe, w tym flawonoidy i kwasy fenolowe, takie jak kwas kawowy i kwas chlorogenowy.7Ponieważ sok jabłkowy jest zazwyczaj spożywany w postaci klarownej, podczas procesu filtracji traci się od 50% do 90% związków fenolowych.8Obecnie konsumenci wybierają produkty minimalnie przetworzone, takie jak mętny sok jabłkowy o wysokiej zawartości polifenoli. Jednak ze względu na wysoką zawartość fenoli, ten rodzaj soku jabłkowego jest szczególnie podatny na przebarwienia i ciemnienie.9Aby zapobiec ciemnieniu soku jabłkowego lub ograniczyć jego ciemnienie, stosuje się różne technologie, w tym metody obróbki cieplnej, takie jak pasteryzacja w temperaturze 60–90°C.10Jednak według badań Saucedy-Gálveza11Obróbka termiczna może zniszczyć lotne substancje chemiczne i wpłynąć na właściwości organoleptyczne soku jabłkowego. Alternatywami dla metod obróbki termicznej są dwutlenek węgla w stanie nadkrytycznym, promieniowanie ultrafioletowe, ultradźwięki, wysokie ciśnienie hydrostatyczne lub homogenizacja wysokociśnieniowa.12Efektywność tych technologii i wydajność odpowiednich soków owocowych zależą od zastosowanych parametrów i właściwości produktu. Ich powszechne zastosowanie jest ograniczone wysokimi kosztami, niekorzystnym wpływem na jakość niektórych produktów spożywczych lub niewystarczającą inaktywacją enzymów.13,14
Lakazę można stosować do stabilizacji i klarowania soku owocowego.15Gökmen i wsp.16Zalecamy stosowanie lakkazy do klarowania soków owocowych, ponieważ skutecznie usuwa związki fenolowe, przekształcając je w polimery lub oligomery, które można łatwo usunąć za pomocą dowolnej membrany ultrafiltracyjnej, co pozwala sokowi jabłkowemu zachować stabilny kolor i klarowność do sześciu tygodni w temperaturze 50°C. Oczyszczoną lakkazę *Trichoderma* unieruchomiono na kulkach z tlenku glinu i wykorzystano do selektywnego usuwania związków o nieprzyjemnym smaku, spowodowanych mikrobiologicznym zanieczyszczeniem soku jabłkowego.17
Około 80–90% lotnych składników soku jabłkowego stanowią estry i aldehydy, które nadają sokowi unikalny aromat.18Lakazę z *Trametes versicolor* unieruchomiono na niedrogim nośniku wykonanym z naturalnego włókna pochodzącego z młodych skorupek kokosa w celu klarowania soku jabłkowego.19Wcześniejsze badania dotyczyły stabilizacji soku jabłkowego (barwy i mętności) przy użyciu metod bezenzymatycznych, immobilizacji lub w połączeniu z ultrafiltracją.5,19Jednak wpływ lakkaz grzybowych na właściwości fizykochemiczne soku jabłkowego podczas przechowywania pozostaje niejasny. Dlatego celem niniejszego badania było eksperymentalne zbadanie zmian właściwości fizykochemicznych, zawartości związków fenolowych i aktywności antyoksydacyjnej soku jabłkowego po obróbce lakkazami grzybowymi i dwutygodniowym przechowywaniu w lodówce. Lakkazy mają zdolność utleniania związków fenolowych, co czyni je obiecującymi do zastosowania w różnych procesach przemysłowych, w tym w klarowaniu soków. W niniejszym badaniu zbadano lakkazy z *Pleurotus ostreatus* NRC 620, koncentrując się na idealnych warunkach dla ich aktywności i skuteczności w klarowaniu soków. Podczas gdy badania nad boczniakami (P. ostreatus NRC 620) są nadal ograniczone, wcześniejsze badania dotyczyły enzymów z różnych źródeł grzybowych, takich jak Trametes versicolor i Ganoderma lucidum. Celem niniejszego badania była ocena potencjalnego zastosowania tego enzymu w przemyśle spożywczym i podkreślenie jego unikalnych właściwości, w szczególności jego idealnego pH i temperatury.
Kwas 2,2′-azooksybis(3-etylobenzotiazolino-6-sulfonowy) (ABTS) zakupiono w firmie Sigma-Aldrich (Kanada). Wszystkie pozostałe odczynniki były jakości analitycznej.
Centrum Zbiorów Kultur Mikrobiologicznych Narodowego Centrum Badawczego (National Research Center) pozyskało znany szczep boczniaka ostrygowatego NRC620. Po pasażowaniu szczep ten przechowywano na skosach agaru ziemniaczano-dekstrozowego w temperaturze 4°C. Metoda przygotowania inokulum była następująca: 10-dniową, w pełni rozwiniętą grzybnię zaszczepiono na płytkach agarowych ziemniaczano-dekstrozowych i inkubowano w temperaturze 28°C. Po 10 dniach, trzy bloczki grzybni o średnicy 12 mm wyjęto z podłoża agarowego za pomocą sterylnego metalowego stempla i umieszczono w 250-ml kolbach Erlenmeyera z wacikami, zawierających 50 ml sterylnego podłoża hodowlanego (pH 5,0, jak opisano wcześniej przez Othmana i in.).20). Hodowle inkubowano w temperaturze 28°C przez 18 dni. Następnie kultury przefiltrowano przez bibułę filtracyjną Whatman nr 1, a powstały supernatant posłużył jako źródło enzymu.
Aktywność lakkazy oznaczano, używając ABTS jako substratu. Mieszanina reakcyjna (2 ml) zawierała 500 μl 0,3 mM ABTS (rozpuszczonego w 0,1 M buforze cytrynianu sodu o pH 4,5) oraz wymaganą ilość próbki enzymu rozcieńczonej wodą destylowaną.21,22Biorąc pod uwagę, że lakkaza może utleniać ABTS w temperaturze pokojowej (28 °C ± 2), utlenianie ABTS określono poprzez pomiar wzrostu absorbancji przy 420 nm (ε420= 36 000 cm-1 M -1) za pomocą spektrofotometru UV Agilent Carry-100. Do utlenienia 1 μmol ABTS na minutę potrzebna była jedna jednostka aktywności lakkazy. Stężenie białka oznaczono metodą Bradforda, stosując albuminę surowicy bydlęcej jako kontrolę wewnętrzną.23,24
Po uzyskaniu enzymu ze szczepu boczniaka ostrygowego NRC 620 mierzono jego aktywność w różnych odstępach czasu hodowli przez 25 dni w warunkach statycznych w temperaturze 28 °C.
Aby zbadać wpływ temperatury na aktywność lakkazy, przeprowadzono eksperymenty w zakresie temperatur od 20 do 90°C. Przed dodaniem enzymu i rozpoczęciem reakcji, bufor (0,1 M cytrynian sodu, pH 4,5) i substrat (ABTS) zmieszano i inkubowano przez 5 minut w różnych temperaturach. Stabilność termiczną enzymu oceniono poprzez inkubację w 0,05 M buforze fosforanu sodu (pH 7,0) w temperaturze odpowiednio 40, 50, 60 i 70°C przez 2 godziny. Następnie oceniono aktywność resztkową z użyciem substratu ABTS.
Wpływ pH na aktywność lakkazy oceniano, stosując ABTS jako substrat w 0,1 M buforach cytrynianowo-fosforanowych o pH od 2,5 do 7,0. Roztwór enzymu inkubowano w temperaturze 40°C przez dwie godziny w 0,1 M buforach cytrynianowym i Tris (pH 3, 4, 6 i 7) w celu oceny stabilności pH. Aktywność resztkową z ABTS jako substratem obliczono po inkubacji.
Lakazę inkubowano przez 10 minut w buforze fosforanu sodu (0,05 M, pH 7,0) zawierającym jony różnych metali (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ i Mn2+) w stężeniach odpowiednio 2,5 mM i 10 mM. Następnie dodano substrat (ABTS) w celu zainicjowania reakcji i oceniono względną aktywność.
Utlenianie ABTS przez lakkazę w różnych stężeniach (0,025–3 mM) mierzono przy pH 4,5 w celu określenia parametrów kinetycznych (Vmax i Km).stałeStałe kinetyczne równania Michaelisa-Mentena obliczono za pomocą wykresu Lineweavera-Burka, który przedstawia odwrotność szybkości reakcji w funkcji stężenia substratu. Stałe kinetyczne obliczono z wykresu Lineweavera-Burka za pomocą oprogramowania GraphPad Prism w wersji 6.01.
Po dokładnym umyciu jabłek wodą z kranu, przekrojono je na pół i wyciśnięto za pomocą w pełni automatycznej sokowirówki do jabłek Braun MP80 (produkowanej w Niemczech). Sok przefiltrowano przez cztery warstwy gazy. W grupie kontrolnej nie dodano żadnych enzymów, natomiast do świeżo przygotowanego soku jabłkowego dodano 2,0% lakkazy (najskuteczniejsze stężenie), a następnie przechowywano go w temperaturze 4°C przez dwa tygodnie.
Kwasowość miareczkową (TA) i pH oznaczano zgodnie z metodą Boultona i in.al.27pH każdej próbki mierzono za pomocą cyfrowego pH-metru (pH-metr JENWAY 3510). Kwasowość miareczkową (TA) obliczono na podstawie kwasu jabłkowego, stosując poniższy wzór.
Gdzie V i C to odpowiednio objętość (ml) i stężenie (0,1 mol/l) roztworu wodorotlenku sodu użytego do miareczkowania. K to współczynnik konwersji kwasu jabłkowego równy 0,067, a W to masa (g) soku jabłkowego.
Całkowita zawartość substancji rozpuszczalnych (TDS) we wszystkich próbkach soku oznaczono za pomocą kieszonkowego refraktometru PAL-1 (ATAGO, Tokio, Japonia). Po każdym pomiarze soczewkę optyczną przepłukano wodą dejonizowaną, a każdą próbkę soku jabłkowego zbadano trzykrotnie. Wartość dla każdej próbki obliczono, uśredniając wyniki z trzech pomiarów. Średnią ± odchylenie standardowe dla każdej próbki soku jabłkowego również obliczono, uśredniając te wyniki.
Lepkosprężystość próbek soku jabłkowego oceniano za pomocą wiskozymetru rotacyjnego (RV, Rheotest 2, Niemcy). Próbkę umieszczono wewnątrz cylindra „S2” wiskozymetru. Lepkość pozorną przedstawiono nachyleniem krzywej naprężenia ścinającego w funkcji szybkości ścinania, którą obliczono na podstawie naprężenia ścinającego i odpowiadających mu krzywych dla różnych szybkości ścinania (od 1,00 do 437,4 s⁻¹). Wzór na obliczenie lepkości pozornej jest następujący:
Gdzie η jest pozorną lepkością (cP), τ jest naprężeniem ścinającym (dyn/cm²), γ jest szybkością ścinania (s⁻¹), a (τ) oblicza się, używając wartości momentu obrotowego (α) i cylindra (Z) według następującego wzoru: τ = Z . α.
Wskaźnik brązowienia oznaczano metodą Meidav i in.al.29Próbkę soku o objętości 10 ml wirowano z prędkością 2750 x g przez 10 minut. 5 ml supernatantu soku zmieszano z 5 ml 95% etanolu. Absorbancję mieszaniny mierzono przy długości fali 420 nm za pomocą spektrofotometru UV Shimadzu (UV-1601 PC).
Całkowitą zawartość fenoli (TPC) oznaczano kolorymetrycznie przy użyciu odczynnika Folina-Ciocalteu, zgodnie z opisem Boultona i in.[27]. Dla stężeń od 0 do 500 mg/l sporządzono krzywą standardową kwasu galusowego (r²= 0,997). Wyniki podano w ekwiwalentach kwasu galusowego (mg GAE/ml).
Dodać 125 μl wody destylowanej i 2850 μl roztworu FRAP do 25 μl soku jabłkowego i pozostawić mieszaninę w ciemności na30min. Następnie zmierz absorbancję przy 593 nm za pomocą spektrofotometru UV Shimadzu (UV-1601 PC). Odczynnik FRAP przygotowano poprzez zmieszanie 300 mM buforu octanowego (pH 3,6), 20 mM chlorku żelaza(III) i 10 mM 2,4,6-tris(2-pirydylo)triazyny (TPTZ) (rozpuszczonej w 40 mM HCl) w stosunku 10:1:1. Wygenerowano krzywą standardową, używając Troloxu jako wzorca (R²= 0,999), a wyniki wyrażono w μM Trolox/ml.
Aktywność antyoksydacyjną soków poddanych obróbce i niepoddanych obróbce określono metodą DPPH, aby ocenić ich zdolność do wychwytywania wolnych rodników DPPH.31Dziesięć mikrolitrów soku zmieszano z 1 ml roztworu DPPH (100 μM) w metanolu. Po 30 minutach reakcji w ciemności zmierzono absorbancję mieszaniny przy długości fali 517 nm za pomocą spektrofotometru UV Shimadzu (UV-1601 PC). Wyniki wyrażono w ekwiwalentach troloksu (μM troloksu/ml) na podstawie krzywej kalibracyjnej (R2= 0,990).
Uzyskane dane wykazały, że maksymalną produkcję lakkazy w boczniakach NRC 620 zaobserwowano pod koniec 18. dnia fermentacji, osiągając aktywność 1302 U/l. Stanowiło to podstawę do określenia optymalnego czasu hodowli dla produkcji lakkazy (rysunek 1). Chociaż produkcja enzymu rosła wraz z wydłużaniem czasu hodowli, tempo wzrostu nie było wprost proporcjonalne do czasu hodowli; po 21 dniach aktywność enzymu wzrosła jedynie o 90 U/l (do 1390 U/l). Dlatego ostatecznie wybrano 18 dni jako optymalny czas hodowli, aby zrównoważyć wydajność produktu z korzyściami ekonomicznymi wynikającymi z wydłużenia czasu hodowli.
Wpływ czasu hodowli na wydajność lakkazy w Pleurotus ostreatus NRC 620. Trzy (12 mm) bloki grzybni grzybni zaszczepiono 50 ml sterylnego podłoża, a następnie hodowano w temperaturze 28 °C przez różny czas.
Zgodnie z wynikami innych badań nasze wyniki wskazują, że idealny okres hodowli pozwalający na osiągnięcie szczytowej sekrecji lakkazy przez grzyby wynosi prawdopodobnie od 7 do 36 dni.32Według Ezike i in.33*Trametes polyzona* WRF03 wyprodukował największą ilość lakkazy pod koniec dziewiątego dnia fermentacji, ze swoistą aktywnością 1637 U/mg białka. Co więcej, Othman i in.34Stwierdzono, że *Trichoderma harzianum* S7113 wydzielała dużą ilość lakkazy piątego dnia hodowli. Tempo produkcji lakkazy osiągnęło szczyt czternastego dnia, a następnie stopniowo spadało.34Chociaż wydzielanie enzymów może mieć miejsce również w trakcie głównej fazy wzrostu, zwykle osiąga ono szczyt w fazie pośredniej i jest wyzwalane przez zużycie źródła węgla lub azotu.34,35
Chociaż lakkaza z Pleurotus ostreatus NRC 620 wykazywała wysoką aktywność w szerokim zakresie temperatur od 50°C do 80°C, zbliżając się do szczytowej aktywności (69–98%), jej maksymalną aktywność zaobserwowano w temperaturze 70°C (rys. 2a). Poza tym zakresem temperatur aktywność enzymu spadała w temperaturze około 70°C. Wyniki te sugerują, że enzym jest aktywny w wysokich temperaturach, prawdopodobnie dlatego, że wysoka temperatura zwiększa energię kinetyczną reakcji.
Wpływ temperatury reakcji (a) i pH (b) na aktywność lakkazy w *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperatury w zakresie od 20 do 90°C uzyskano poprzez wstępną inkubację mieszaniny w różnych temperaturach przez 5 minut przed dodaniem enzymu i rozpoczęciem reakcji. Wpływ pH na aktywność lakkazy oceniano, stosując ABTS jako substrat w roztworach zawierających 0,1 M bufor cytrynianowo-fosforanowy w zakresie pH od 2,5 do 7,0.
Według Ezike etszt.33optymalna temperatura dla lakkazy WRF03 *Trametes polyzona* wynosi 55 °C, czyli tyle samo, co dla *Ganoderma lucidum*lakkaza36i podobna do optymalnej temperatury (50 °C) dla *Trametes polyzona* KU-RNW02737lakkaza . Baldrian38zauważa, że podobnie jak w przypadku innych układów enzymatycznych rozkładających ligninę, idealny zakres temperatur dla lakkazy wynosi od 50 do 70 °C.
Wyniki pokazały, że enzym wykazywał najwyższą aktywność przy pH 3,0, osiągając 94% aktywności przy pH 3,5. Jednakże pozostawał aktywny w szerokim zakresie pH od 2,5 do 7,0 (rysunek 2b). Ponadto wykazywał wyższą aktywność w warunkach kwaśnych w porównaniu do warunków obojętnych lub zasadowych. Jego aktywność utrzymywała się na poziomie co najmniej 77% w zakresie pH od 2,5 do 4,5, ale osiągnęła jedynie około 38% przy pH 7,0. Optymalne pH dla lakkazy z *Trametes polyzona* WRF03 wynosiło 4,533, co jest takie samo jak pH dla lakkaz z *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 i *Trametes hirsuta* 41. Jednakże, zgodnie z badaniem Chairin i in.42Optymalne pH dla lakkazy z *Polymorpha f. sp.* WR710-1 wynosi 2,2, natomiast dla lakkazy z *Polymorpha f. sp.* IBL-04 wynosi 5,043. Wiązanie anionów wodorotlenkowych (inhibitor lakkazy) z atomami miedzi lakkazy T2/T3 może być przyczyną obniżonej aktywności lakkazy w warunkach pH obojętnego lub zasadowego. Może to zaburzyć wewnętrzny transfer elektronów z centrum T1 do centrum T2/T3, a tym samymograniczającyaktywność enzymu23,44
Inkubując enzym w różnych temperaturach, stwierdzono, że zarówno czas, jak i temperatura inkubacji wpływają na stabilność enzymu. Co ciekawe, lakkaza z *Trametes polyzona* NRC 620 wykazywała wyższą stabilność w temperaturach 40°C i 50°C, zachowując odpowiednio 68,33% i 59,61% swojej początkowej aktywności po 120 minutach (rysunek 3a). Natomiast w tych samych warunkach (40°C i 50°C, 120 minut) lakkaza z *Trametes polyzona* WRF03 zachowała odpowiednio 64,38% i 42,92% swojej aktywności.33Z kolei wydłużenie czasu i temperatury inkubacji zmniejszyło stabilność lakkazy *Trametes polyzona* NRC 620; po 60 minutach inkubacji w temperaturach 60°C i 70°C jej aktywność spadła odpowiednio do 39,24% i 1,72% (rysunek 3a). Zgodnie z wynikami eksperymentów, lakkaza z *Trametes polyzona* WRF03 wykazała wyższą stabilność w temperaturach 40°C i 50°C przez cały proces obróbki termicznej.33Podobnie Lueangjaroenkit ial.37i Chairin etal.42opublikowano dane dotyczące stabilności lakkaz z Trametes polyzona KURNW027 i Trametes polyzona WR710-1 w temperaturze 50°C przez 1 godzinę. Jako użyteczny biokatalizator mający zastosowanie w różnych dziedzinach biotechnologii, lakkaza powinna charakteryzować się dobrą stabilnością i wydajnością w szerokim zakresie temperatur.
Stabilność termostatyczna (a) i stabilność pH (b) lakkazy z *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Stabilność termostatyczna została oceniona poprzez inkubację roztworu enzymu w 0,05 M buforze fosforanu sodu (pH 7,0) w temperaturze odpowiednio 40, 50, 60 i 70°C przez 2 godziny. Stabilność pH została oceniona poprzez inkubację roztworu enzymu w 0,1 M buforze cytrynianowym i buforze Tris (pH 3, 4, 6 i 7) w temperaturze 40°C przez 2 godziny. Aktywność resztkową obliczono, stosując ABTS jako substrat po inkubacji.
Aby określić optymalne warunki użytkowania i przechowywania enzymu, zbadaliśmy wpływ pH na stabilność lakkazy. Ekspozycja na różne wartości pH znacząco wpłynęła na stabilność struktury białka, wpływając tym samym na stabilność i aktywność cząsteczki enzymu. Wyniki wykazały, że enzym był mniej stabilny w środowisku kwaśnym, podczas gdy wykazywał lepszą stabilność przy wyższych wartościach pH (obszary obojętne i zasadowe). Przy wartościach pH 7,0, 6,0, 4,0 i 3,0 wskaźniki retencji enzymu po 120 minutach wynosiły odpowiednio około 100%, 62,54%, 52,39% i 11,14% (rys. 3b). Lakaza *Strombus multisus* WRF03 wykazywała wyższą stabilność przy neutralnych wartościach pH (5,5–6,5) i niższą stabilność przy kwaśnych wartościach pH (poniżej 4,0). Po 120 minutach przy wartościach pH wynoszących 5,5, 6,0 i 6,5, wskaźniki retencji enzymu wynosiły odpowiednio około 82%, 100% i 93%.33Khairin i wsp.42zauważyli, że lakkaza z Trametes polyzona WR710-1 była stabilna w zakresie pH od 6,0 do 7,0, podczas gdy Sayed i in.45Badania wykazały, że lakkaza była bardziej stabilna w warunkach neutralnego pH. Jednak lakkaza z Cerrena unicolor wykazywała również stabilność w warunkach zasadowych (pH 9,0).46Badane lakkazy wykazały wysoką stabilność w szerokim zakresie pH. Może to być istotna cecha w zastosowaniach przemysłowych.
Ponieważ niektóre jony metali wywierają zarówno stymulujący, jak i hamujący wpływ na aktywność enzymów, ich wpływ na aktywność enzymów musi być brany pod uwagę w zastosowaniach przemysłowych. Jest to kluczowe, ponieważ jony metali są powszechnymi zanieczyszczeniami środowiska, które mogą wpływać na stabilność i syntezę enzymów pozakomórkowych.47Aby zbadać wpływ wielu jonów metali na lakkazę z *Pleurotus ostreatus* NRC 620, przeprowadziliśmy odpowiednie eksperymenty. Jak pokazano na rysunku 4, w zależności od rodzaju użytego metalu, zwiększenie stężenia jonów metali z 2,5 mM do 10 mM negatywnie wpływało na funkcję enzymu. Na przykład,Mg²⁺ , Współczynnik²⁺ , Zn²⁺, ICu²⁺może stymulować i aktywować aktywność enzymu, podczas gdyNa⁺ , Mn²⁺ , Wapń²⁺, IK⁺może hamować aktywność enzymu. W stężeniu 10 mM jony Cu²⁺ i Mg²⁺ były najsilniejszymi aktywatorami aktywności lakkazy z *Pleurotus ostreatus* NRC 620, zapewniając stopień aktywacji odpowiednio około 34% i 20%. Natomiast w stężeniu 10 mM jony Ca²⁺ były najsilniejszym inhibitorem lakkazy, zmniejszając aktywność enzymu o około 60%.
Wpływ jonów metali na aktywność lakkazy Pleurotus ostreatus NRC 620. Lakazę inkubowano przez 10 minut w buforze fosforanu sodu (0,05 M, pH 7,0) zawierającym różne jony metali w stężeniach 2,5 mM i 10 mM. Następnie reakcję zainicjowano przez dodanie substratu (ABTS), po czym zmierzono względną aktywność.
Nasze wyniki są zgodne z wynikami innych autorów, którzy stwierdzili, że Mg²⁺ i Cu²⁺ wzmacniają aktywność *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño i in.⁴⁸ stwierdzili, że lakkaza z *Xylaria* sp. jest w pewnym stopniu stymulowana przez jony miedzi (Cu²⁺). Ponadto Foroutanfar i in.⁴⁹ oraz Si i in.⁵⁰ przeprowadzili podobne badania na lakkazach z *Paraconiothyrium variabile* i *Trametes pubescens*, odpowiednio. Miejsce wiązania miedzi typu II (T2) tego enzymu może być nasycone Cu²⁺ przy danym stężeniu, co może wyjaśniać stymulację aktywności lakkazy przy wyższych stężeniach Cu²⁺³⁹. Ponieważ lakkazy grzybów białej zgnilizny są oksydazami zawierającymi wiele atomów miedzi, wpływ jonów miedzi na aktywność lakkazy jest różnorodny i waha się od stymulującego i hamującego do neutralnego.⁵¹ Z kolei Zhou i in.. [52]poinformował, żeCu²⁺hamowały aktywność lakkazy termita podziemnego tajwańskiego (Odontotermes formosanus). Jednakże lakkazy Cerena sp. HYB07[53]i Clitocybe maxima[54]nie uległy wpływowi jonów miedzi.
Specyficzność substratu została przedstawiona za pomocą jego parametrów kinetycznych (Km i Vmax); im silniejsze powinowactwo wiązania substratu do enzymu, tym niższa wartość Km i wyższa specyficzność substratu.3,21,55Parametry kinetyczne (Km i Vmax) lakkazy z *Pleurotus ostreatus* NRC 620 wyznaczono za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 6.0, kreśląc wykres Lineweaver-Burka (rysunek 5). Przy użyciu ABTS jako substratu, wyniki wyniosły 1,99 mM i 16217 μmol.min⁻¹ L⁻¹,odpowiednio. Elsayed i in.21donieśli, że wartości Km dla utleniania ABTS wynosiły odpowiednio 0,1 mM i 0,064 mM, co wskazuje na wysokie powinowactwo izoenzymów Lac A i Lac B do ABTS. Ponadto wartości Vmax wynosiły 0,182 μmolmin⁻¹i 0,603 μmolmin⁻¹, odpowiednio. Uzyskana wartość Km była niższa niż w przypadku Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); ponadto ich wartość Vmax (1429 mmol min⁻¹) była równieżniżejprzy użyciu ABTS jako substratu.33 Podobnie wartości Km stężeń lakkazy Lentinus squarrosulus MR13 i Trametes sp. AH28-2 wynosiły odpowiednio 0,0714 mM i 0,025 mM, a wartości Vmax wynosiły odpowiednio 0,0091 mM min−1 i 0,67 mM min−1 mg−1 (w odniesieniu do ABTS).odpowiednio.56,57
Zbadano wpływ stężenia ABTS na aktywność lakkazy z *Pleurotus ostreatus* NRC 620 i sporządzono wykres Lineweavera-Burka odwrotności początkowej prędkości reakcji w funkcji stężenia ABTS. Reakcję utleniania ABTS przy różnych stężeniach lakkazy (0,025–3,0 mM) mierzono przy pH 4,5 w celu określenia parametrów kinetycznych (Vmax i Km). Stałe kinetyczne Michaelisa-Mentena obliczono za pomocą wykresu Lineweavera-Burka odwrotności prędkości reakcji w funkcji stężenia substratu. Stałe kinetyczne obliczono z wykresu Lineweavera-Burka za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 6.01.
Tradycyjne enzymy klarujące, takie jak pektynazy, hydrolizują substancje pektynowe, zmniejszając lepkość i mętność. Skutecznie rozkładają polisacharydy strukturalne i są często stosowane w połączeniu z innymi enzymami, takimi jak celulazy i hemicelulazy, w celu poprawy wydajności i klarowności. Pektynazy nie działają jednak specyficznie na związki fenolowe, które są głównymi czynnikami powodującymi mętność i brązowienie oksydacyjne, szczególnie w sokach takich jak sok jabłkowy i winogronowy.58Natomiast lakkazy katalizują utlenianie związków fenolowych, polimeryzując je do większych, nierozpuszczalnych cząsteczek, które można usunąć poprzez sedymentację lub filtrację. Mechanizm ten nie tylko poprawia klarowność, ale także wydłuża okres przydatności do spożycia soku, zmniejszając prawdopodobieństwo brązowienia oksydacyjnego spowodowanego przez związki fenolowe. Co więcej, procesy klarowania z wykorzystaniem lakkazy można przeprowadzać w łagodnych warunkach przetwarzania (pH 3,5–5,5, temperatura 25–40°C), dzięki czemu nadają się do delikatnych soków bez utraty ich właściwości odżywczych i organoleptycznych.59Badania wykazały, że obróbka pektynazą pozwala na klarowanie soku w ciągu 1–2 godzin, podczas gdy obróbka lakkazą zazwyczaj wymaga dłuższego czasu reakcji (3–6 godzin), aby całkowicie zredukować związki fenolowe. Proces ten można jednak zoptymalizować poprzez immobilizację enzymu lub połączenie lakkazy z mechanicznymi metodami klarowania.60W niniejszym badaniu profilowanie enzymatyczne surowego ekstraktu wykazało znaczącą aktywność lakkazy i α-amylazy, podczas gdy aktywność pektynazy i ksylanazy była wyjątkowo niska, a aktywności celulazy nie wykryto. Zatem zmniejszenie zmętnienia i zawartości fenoli było spowodowane głównie działaniem lakkazy, podczas gdy zmiana lepkości mogła być częściowo spowodowana działaniem amylazy.
Tabela 1 przedstawia parametry fizykochemiczne świeżo wyciskanego soku jabłkowego i próbek poddanych działaniu lakkazy. Wyniki wykazały, że wydajność świeżo wyciskanego soku jabłkowego (71,59%) była niższa niż w przypadku próbek poddanych działaniu lakkazy (87,34%). Wyniki te są zgodne z wynikami badań Pilnika i Orange'a.61, który wskazał, że zastosowanie enzymów w przetwórstwie owoców może zwiększyć wydajność soku, poprawić filtrację i uzyskać wysokiej jakości, klarowny sok do zagęszczania. Wzrost wydajności soku wynika głównie ze wzrostu zawartości cukrów rozpuszczalnych w soku. Podczas enzymatycznej hydrolizy owoców, mezoglea i pektyny w ścianach komórkowych produktu ulegają rozpadowi i przekształcają się w substancje rozpuszczalne, takie jak cukry obojętne i kwasy.62 .Wartość pH soku jabłkowego poddanego działaniu enzymu była istotnie niższa niż w grupie kontrolnej (P < 0,05), a wartość pH w obu grupach istotnie wzrosła podczas przechowywania (tab. 1). Wyniki te są zgodne z wynikami badań Marka i in.63, który zauważył, że pH soku z nerkowców spadło po przechowywaniu i obróbce cieplnej. Degradacja pektyny i powstawanie kwasu galakturonowego po obróbce enzymatycznej mogą być odpowiedzialne za wzrost pH podczas przechowywania. pH próbek poddanych obróbce enzymatycznej utrzymywało się w zakresie od 4,05 do 4,31 przez cały okres przechowywania, podczas gdy pH niepoddanego obróbce soku jabłkowego wahało się w zakresie od 4,12 do 4,33.
Kwasowość całkowita (TA) zarówno w próbkach niepoddanych obróbce, jak i poddanych obróbce lakkazą wykazywała tendencję spadkową wraz z wydłużającym się czasem przechowywania (tabela 1). Spadek kwasowości przypisano przekształcaniu kwasów organicznych w węglowodany lub reakcjom enzymatycznym, a także utlenianiu podczas przechowywania soku.64Całkowita kwasowość kontrolnego soku jabłkowego i próbek poddanych działaniu enzymów była niższa niż w przypadku innych soków (sok truskawkowy 0,9%, sok śliwkowy 2,2%, sok z kumkwatu 1,0%, sok morelowy 2,4%, sok pomarańczowy 0,8%), ale podobna do kwasowości innych soków (np. sok gruszkowy 0,3%).62Różnice w jakości świeżo wyciśniętego soku jabłkowego mogą wynikać z różnych czynników, takich jak warunki uprawy, czynniki genetyczne, stopień dojrzałości i metody przetwarzania.65Spadek całkowitej kwasowości soku jabłkowego kontrolnego i poddanego działaniu lakkazy jest zgodny z wynikami przedstawionymi przez Singh i in.66dotyczące spadku całkowitej kwasowości soku jabłkowego Jin Nuo po 74 dniach przechowywania. Z drugiej strony Oshmiansky i Wojdylo67nie stwierdzono żadnych istotnych zmian w kwasowości soku jabłkowego podczas badania wpływu tradycyjnych metod klarowania.
Wyniki przedstawione w tabeli 1 wskazują, że wartość całkowitej zawartości substancji rozpuszczalnych (TSS) w soku jabłkowym poddanym działaniu lakkazy była wyższa niż w próbce niepoddanej działaniu lakkazy. Wyniki te są zgodne z opublikowanymi badaniami.. 68Co więcej, z tabeli 1 wynika, że wartość TSS w grupie kontrolnej soku jabłkowego wynosiła 9,58 w punkcie początkowym i osiągnęła 11,05 pod koniec okresu przechowywania. Wartości te są niższe niż wartości TSS świeżego soku jabłkowego podane przez Hamida i in.. 69(odpowiednio 11,2 i 11,80). Wartość TSS próbek soku jabłkowego poddanego działaniu lakkazy znacznie wzrosła, zaczynając od 11,23 i osiągając 12,93 po dwóch tygodniach przechowywania w temperaturze 4°C (Tabela 1). Podobny wzrost TSS podczas przechowywania zaobserwowano również w przypadku owoców cytrusowych, cytryn i słodkich pomarańczy. Wzrost całkowitej rozpuszczalnej substancji stałej (TSS) podczas przechowywania może być spowodowany hydrolizą polisacharydów (skrobi) do monosacharydów (cukrów), wzrostem stężenia spowodowanym odwodnieniem soku i degradacją pektyny w soku do rozpuszczalnych substancji stałych. Wzrost całkowitej rozpuszczalnej substancji stałej (TSS) jest prawdopodobnie spowodowany wzrostem rozpuszczalnych cukrów, które mogą powstawać w wyniku przekształcania pektyny lub celulozy w rozpuszczalne cukry przez odpowiednio pektynę lub celulazę, lub w wyniku hydrolizy skrobi do cukrów, jak donieśli Hamed i in.69.Wpływ lakkazy na właściwości soku jabłkowego można zaobserwować wizualnie, ponieważ sok jabłkowy poddany działaniu lakkazy charakteryzuje się lepszą płynnością i niższą lepkością niż sok niepoddany działaniu enzymu. Obserwację tę przedstawiono w tabeli 1. Lepkość próbki poddanej działaniu enzymu wyniosła 1,87 cP, podczas gdy lepkość próbki kontrolnej wyniosła 2,95 cP. Ten znaczny spadek lepkości prawdopodobnie wynika z wyższej zdolności substancji pektynopodobnych do zatrzymywania wody oraz tworzenia spójnej struktury sieciowej.
W niniejszym badaniu zbadano wpływ lakkazy na indeks brązowienia (BI) soku jabłkowego, mierząc absorbancję przy długości fali 420 nm za pomocą spektrofotometru. Wyniki przedstawiono w tabeli 1. Podczas przechowywania, BI próbek soku jabłkowego, zarówno w grupie poddanej działaniu środka, jak i w grupie niepoddanej działaniu środka, wykazywało stopniowy trend wzrostowy. BI odzwierciedla stopień brązowienia i może służyć jakoważnywskaźnik reakcji brunatnienia enzymatycznego i nieenzymatycznego. Absorbancja znacząco wzrosła podczas przechowywania (P < 0,05). Pod koniec przechowywaniaA420Wartość próbek soku jabłkowego w grupie kontrolnej i grupie poddanej działaniu enzymu wzrosła odpowiednio o około 217% i 121% (Tabela 1). Wyniki wskazują, że obróbka enzymatyczna może skutecznie zmniejszyć stopień brązowienia o około 56%. Wyniki Bezerry i in.[19] są zgodne z naszymi wynikami. Do klarowania soku jabłkowego użyli lakkazy, glutaraldehydu i błonnika kokosowego, co spowodowało redukcję jego pierwotnego koloru o 61%.
Chociaż polifenole zawarte w sokach owocowych mają pozytywny wpływ odżywczy i terapeutyczny na organizm człowieka, mogą również reagować z białkami, powodując zmętnienie soku, sedymentację lub mętność, zmieniając w ten sposób smak i aromat produktu oraz skracając jego okres przydatności do spożycia.71Celem niniejszego badania było bezpieczne obniżenie zawartości związków fenolowych w soku jabłkowym za pomocą lakkazy z Pleurotus ostreatus NRC 620. Wyniki przedstawione w tabeli 1 pokazują, że całkowita zawartość związków fenolowych w soku jabłkowym poddanym działaniu lakkazy uległa istotnemu obniżeniu przed przechowywaniem w temperaturze 4°C. Co więcej, całkowita zawartość związków fenolowych również zmniejszyła się podczas przechowywania w obu badanych próbkach (tabela 1). Badania Sandri i in.72Wykazano, że sok jabłkowy poddany obróbce enzymatycznej może zachować swoją aktywność przeciwutleniającą i zawartość związków fenolowych. Jednakże wyniki badania przeprowadzonego przez Lettera i in.73wykazują, że obróbka soku pomarańczowego lakkazą grzybową może zmniejszyć zawartość związków fenolowych nawet o 45%.
Wykazano, że związki fenolowe mają właściwości wychwytywania wolnych rodników, redukcji tlenu singletowego i gaszenia go, przenoszenia atomów wodoru i przekazywania elektronów wolnym rodnikom, co czyni je silnymi przeciwutleniaczami.74Dlatego w niniejszym badaniu wykorzystano metody oparte na DPPH i FRAP do oceny wpływu lakkazy na aktywność przeciwutleniającą soku jabłkowego przechowywanego w lodówce przez 14 dni (tabela 2). Obie metody wykazały wzrost aktywności przeciwutleniającej podczas przechowywania, co może być spowodowane wzrostem ilości wolnych związków fenolowych lub powstawaniem produktów reakcji Maillarda (MRP), przy czym produkty reakcji Maillarda prawdopodobnie są przyczyną wzrostu aktywności przeciwutleniającej.75Nieenzymatyczne reakcje brunatnienia (w tym degradacja kwasu askorbinowego, reakcje Maillarda i katalizowana kwasem degradacja cukrów) prowadzą do powstania brązowych pigmentów (melanoidyn). Pośrednie produkty degradacji kwasu askorbinowego i produkty degradacji cukrów (takie jak związki karbonylowe) mogą reagować z aminokwasami poprzez reakcje Maillarda.76Chociaż zjawisko brązowienia owoców i warzyw podczas przechowywania zostało dokładnie zbadane, nasza wiedza na temat tych reakcji jest nadal ograniczona.77W porównaniu z metodą FRAP, sok jabłkowy z dodatkiem lakkazy wykazał istotnie niższą aktywność antyoksydacyjną w metodzie DPPH (tabela 2), a aktywność antyoksydacyjna wszystkich próbek istotnie wzrosła wraz z wydłużającym się czasem przechowywania. W niniejszym badaniu zastosowano dwie różne metody oznaczania aktywności antyoksydacyjnej, ponieważ ich zasady działania się różnią. Metoda DPPH mierzy zdolność neutralizacji wolnych rodników, natomiast metoda FRAP mierzy zdolność redukcji jonów żelaza. Dlatego zaleca się stosowanie wielu metod oznaczania aktywności antyoksydacyjnej, aby lepiej zrozumieć aktywność antyoksydacyjną badanych próbek.78
Jednym z kluczowych ustaleń tego badania jest to, że lakkaza NRC 620 z *Pleurotus ostreatus* wykazuje optymalną aktywność w temperaturze 70°C i pH 3,0. W porównaniu z innymi lakkazami grzybowymi powszechnie stosowanymi do klarowania soków, takimi jak lakkazy z *Trametes versicolor* i *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 charakteryzuje się wyższą stabilnością termiczną i bardziej kwaśnym pH. Lakazy z *Trametes versicolor* i *Ganoderma lucidum* zazwyczaj wykazują optymalną aktywność w zakresie temperatur 50–60°C i przy wartościach pH od 3,5 do 5,0. Ta różnica może przyczyniać się do poprawy wydajności klarowania soku, szczególnie w przypadku soków kwaśnych, gdzie stabilność przy niższych wartościach pH ma kluczowe znaczenie. Unikalną cechą *P. W porównaniu z innymi badanymi lakkazami grzybowymi, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 wykazuje zdolność do efektywnego działania w trudniejszych warunkach. Jego wyższa optymalna temperatura aktywności sugeruje potencjalne korzyści w zastosowaniach przemysłowych, takie jak szybsze tempo reakcji i mniejsze zanieczyszczenie mikrobiologiczne. Jego niskie pH, dobrze dostosowane do kwaśnego charakteru wielu soków, może być przydatne w procesach klarowania soków. Wyniki te uzasadniają dalsze badania nad zastosowaniem na dużą skalę, czyniąc *Pleurotus ostreatus* NRC 620 realną alternatywą dla tradycyjnych źródeł lakkazy grzybowej. W porównaniu z poprzednimi badaniami stwierdziliśmy, że optymalna temperatura wynosi 60°C, a optymalne pH 3,0. Po 80 minutach reakcji w temperaturze 60°C, lakkaza z *Ganoderma lucidum* zachowała46% swojej aktywności.79 Według Kurniawati i Nicelle80Enzymy *Ganoderma lucidum* wykazują doskonałą do umiarkowanej stabilność w temperaturze 25°C i przy pH w zakresie od 5,0 do 8,0 oraz stabilność przy pH 6,0 i temperaturach od 10 do 30°C. W niniejszym badaniu stwierdziliśmy, że optymalne pH i temperatura dla aktywności enzymu dla *Pleurotus ostreatus* wynosiły odpowiednio 3,0 i 70°C. Po dwugodzinnej inkubacji w temperaturze 40°C i 50°C enzym zachował odpowiednio 68,33% i 59,61% swojej aktywności. Ponadto lakkaza NRC 620 z Pleurotus ostreatus wykazywała wysoką aktywność w szerokim zakresie temperatur od 50°C do 80°C, osiągając niemal maksymalną aktywność (69%–98%), przy czym maksymalną aktywność obserwowano w temperaturze 70°C.
Podsumowując, lakkaza NRC620 z boczniaka, otrzymana w warunkach statycznych, wykazała optymalną aktywność i stabilność w szerokim zakresie pH i temperatury, wykazując lepszą stabilność w porównaniu z innymi źródłami enzymów. Dodatek 10 mM MgSO₄ i CuSO₄ zwiększył aktywność enzymu odpowiednio o około 21% i 35%. Po przetworzeniu na sok jabłkowy, enzym obniżył pH i lepkość, podczas gdy zawartość fenoli spadła tylko nieznacznie podczas przechowywania.
Wyniki potwierdzają potencjał lakkazy w przemyśle spożywczym, szczególnie w klarowaniu napojów. Poprzez specyficzny rozkład związków fenolowych, lakkaza nie tylko redukuje zmętnienie i poprawia klarowność, ale także utrzymuje jakość soków owocowych w łagodnych warunkach pracy. W przeciwieństwie do tradycyjnych środków klarujących, takich jak żelatyna, bentonit i żel krzemionkowy, lakkaza nie generuje odpadów ani nie usuwa przyjemnych aromatów z napojów, co czyni ją bardziej przyjazną dla środowiska i zrównoważoną opcją. Co więcej, w porównaniu z innymi enzymami i metodami filtracji, lakkaza oferuje ukierunkowane i ekonomiczne rozwiązanie bez uszczerbku dla jakości produktu.
Kyomuhimbo, HD i Brink, HG. Zastosowania i strategie immobilizacji lakkaz zawierających miedź; przegląd. Heliyon 9, e13156 (2023).
Czas publikacji: 15 grudnia 2025 r.